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介紹和解釋實驗室儀器的工作原理、操作步驟、維護保養、技術規范、應用案例等內容
群體感應(QS)介導的動態調控已成為優化微生物產物產量的有效策略。然而，現有的QS回路通常構建于異源系統中，需經過繁瑣的測試與優化過程進行精細調諧，這限制了其在工業微生物中的應用。本研究在工業雷帕霉素生產菌株——雷帕霉素鏈霉菌(Streptomyces rapamycinicus)中，通過將內源QS系統與CRISPRi直接整合，設計了一種新型QS回路(命名為EQCi)。EQCi結合了QS系統與CRISPRi的雙重優勢，能夠實現對多個靶標可調諧、自主且動態的同步調控。利用EQCi，研究團隊分別下調了必需通路中的三個關鍵節點，將代謝流導向雷帕霉素的生物合成途徑，顯著提高了其產量。進一步應用EQCi對這三個關鍵節點進行協同調控并精細調節抑制強度，雷帕霉素產量提升了約660%，達到目前報道的最高產量(1836±191 mg/L)。
值得注意的是，與導致生長停滯和產量次優的靜態工程策略相比，基于EQCi的調控在顯著提高雷帕霉素產量的同時不影響細胞生長，表明該策略能夠實現必需代謝與產物合成之間的平衡。綜上所述，本研究為工業菌株改良提供了一種便捷高效的策略，并展示出在其他工業微生物中推廣的潛力。
After centrifugation at 5000 g, cell pellets were suspended in 7 ml of the protein purification buffer (50 mM Tris–HCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycerol, pH 7.9) and lysed by sonication using the sonicator, JY92-IIN (SCIENTZ, China).
在5000 g離心后，將細胞沉淀重懸于7 mL蛋白純化緩沖液(50 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、50 mM NaCl、5%甘油，pH 7.9)中，并使用超聲波破碎儀JY92-IIN(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國寧波)進行超聲破碎裂解。
以本篇論文為例，研究團隊在開展Western-blot蛋白分析前，使用新芝JY92?IIN型超聲波破碎儀對雷帕霉素鏈霉菌進行超聲裂解。雷帕霉素鏈霉菌是革蘭氏陽性放線菌，細胞壁厚實致密，若裂解不徹底，目標蛋白無法有效釋放，后續蛋白定量、電泳分離及條帶檢測均將失去可靠基礎。新芝JY92?IIN憑借穩定的超聲輸出和高效裂解能力，在短時間內完成菌體破碎，同時通過冰浴或低溫循環有效控制升溫，避免蛋白變性，為研究團隊獲取高質量蛋白樣品、順利開展下游分析提供了堅實保障。
本篇論文所用的JY92?IIN，屬于新芝JY?N系列數字型超聲波細胞粉碎機。該系列采用數字超聲電源與高性能DSP處理器，結合數字頻率合成及鎖相環復合控制技術，具備高精度自動追頻和寬范圍頻率自適應能力(20～25 kHz自動跟蹤)。輸出功率1%～100%連續可調，處理量100 μL～500 mL，可保存50組程序。無論是細胞裂解、蛋白提取、核酸片段化還是納米材料分散，新芝JY?N系列均為科研場景提供穩定可靠的樣品前處理解決方案。
Tian J, Yang G, Gu Y, et al. Developing an endogenous quorum-sensing based CRISPRi circuit for autonomous and tunable dynamic regulation of multiple targets in Streptomyces[J]. Nucleic Acids Research, 2020. 48(14): 8188-8202. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa602.
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